异体骨异位诱导预制骨皮瓣过程中的病理变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.44.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (44): 7733-7738.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.44.013

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异体骨异位诱导预制骨皮瓣过程中的病理变化

韩清銮，栗威，范洪进，张波，李正勋

山东济宁医学院附属医院手足外科，山东省济宁市 272029

出版日期:2013-10-29 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 栗威，硕士，副主任医师，山东济宁医学院附属医院手足外科，山东省济宁市 272029 liweimails@163.com
作者简介:韩清銮，男，1969年生，山东省济宁市人，汉族，1990年潍坊医学院毕业，副主任医师，主要从事四肢创伤修复与功能重建研究。 swkhql@163.com
基金资助:
山东省自然科学基金委员会资助项目(ZR2009CL010)*；山东省济宁市科学技术委员会资助项目(济科字 2009-56号)*

Pathological changes in the preparation of bone-skin flap with allogeneic bone induction

Han Qing-luan, Li Wei, Fan Hong-jin, Zhang Bo, Li Zheng-xun

Department of Hand and Foot Surgery, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, Shandong Province, China

Online:2013-10-29 Published:2013-10-31
Contact: Li Wei, Master, Associate chief physician, Department of Hand and Foot Surgery, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, Shandong Province, China liweimails@163.com
About author:Han Qing-luan, Associate chief physician, Department of Hand and Foot Surgery, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272029, Shandong Province, China swkhql@163.com
Supported by:
Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2009CL010*; Fund Project of Shandong Province Jining Municipal Science and Technology Commission, No. Jikezi 2009-56*

摘要/Abstract

摘要：

背景：用自体骨皮瓣移植是目前修复复合组织缺损的最好方法，但其修复能力有限、创伤大、造成新的组织缺损和一定功能障碍。异体骨具有骨诱导能力，可能用来预制骨皮瓣。
目的：观察异体骨异位埋植诱导预制骨皮瓣过程中异体骨的病理变化。
方法：实验动物为广西巴马微型猪，将深低温冷冻异体骨埋植于旋髂浅动脉供养的皮瓣组织内，植入后在体观察局部反应情况，于植入后4，8，12，16周随机取出异体骨，行大体观察及病理切片镜下观察。
结果与结论：所有异体骨植入处无明显炎症反应。病理检查可见异体骨在皮瓣组织内埋植后4周异体骨表层出现血管化，未见明显类骨母细胞；植入后8周出现异体骨不同程度的血管化、骨吸收和分布不均的类骨母细胞和类破骨细胞，有新骨形成；植入后12周新骨形成进一步增加，但骨吸收亦加重，植入骨形态改变；植入后16周异体骨碎裂吸收，新骨形成无明显增加。结果提示异体骨异位埋植预制骨皮瓣过程中，异体骨随时间不断发生病理变化，需适时移植。

关键词: 组织移植, 骨皮瓣, 异位成骨, 骨诱导, 异体骨, 微型猪, 病理, 复合组织缺损, 间充质细胞, 骨母细胞, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Autologous bone-skin flap transplantation is the best method for the repair of composite tissue defect, but the repair ability is limited, with big trauma, new tissue defect and a certain dysfunction. Allogeneic bone has the osteoinductive capacity, which can be used to prepare the bone-skin flap.
OBJECTIVE: To research the pathological change of the allogenic bone during the prefabrication of bone-skin flap with allogeneic bone implant.
METHODS: The experimental animals were Bama miniature pigs. Deep-frozen allogenic bone was implanted in iliac artery-supported tissue flap compartment of miniature pigs. After operation, the local reactions were observed, the allogenic bone were studied by general observation and histological analysis at 4, 8, 12 and
16 weeks after implantation respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Obvious inflammation reaction was not observed in the surgical zone. The allogeneic bone was vascularized at 4 weeks after implanted into the flap tissue without obvious osteoblast-like cells. The vascularization, bone resorption and uneven distributed osteoblast-like cells and osteoclast-like cells were observed at 8 weeks after implantation, and new bone formation was observed. At 12 weeks after implantation, new bone formation and bone absorption was strengthened, and the morphology of the bone graft was changed. At 16 weeks after implantation, allogenic bone turned into fragments and absorbed, and no new bone formation was observed. The results indicated that during the prefabrication of bone-skin flap with allogeneic bone implantation, the pathological changes of the allogeneic bone was observed with time prolonging, and the bone-skin flap should be transplanted in time.

Key words: tissue transplantation, surgical flaps, stromal cells, cryopreservation, osteoclasts

中图分类号:

R318

韩清銮，栗威，范洪进，张波，李正勋. 异体骨异位诱导预制骨皮瓣过程中的病理变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(44): 7733-7738.

Han Qing-luan, Li Wei, Fan Hong-jin, Zhang Bo, Li Zheng-xun. Pathological changes in the preparation of bone-skin flap with allogeneic bone induction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(44): 7733-7738.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验建立异体骨植入微型猪模型共6只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 局部体征及大体病理变化 所有动物无死亡，植入后切口均全部愈合，无感染，局部亦无明显炎症反应。植入后4周，异体骨植入处可明显触及骨块，大体病理表现异体骨为瘢痕结缔组织包裹，异体骨形态无明显变化；植入后8周异体骨局部仍可触及明显骨块，局部组织质软，大体病理表现异体骨为薄层结缔组织包裹；植入后12周异体骨植入局部骨块较前减小，局部组织质软，大体病理表现结缔组织包裹的异体骨整体缩小，骨块形态轮廓触不清；植入后16周骨块植入区已难以触及明显骨骨块，可触及形态不规则结节，大体病理表现异体骨已明显吸收，局部组织已变成瘢痕样组织和散在骨样组织，见图2。

2.3 组织病理变化见图3-6。

植入前异体骨的病理切片示异体骨内骨细胞及残存的血细胞已变性、崩解，无活细胞存在，仅有骨支架。植入后4周病理切片显示异体骨本身无明显变化，其周围为瘢痕组织包裹，浅表有一定的血管化；植入后8周病理切片检查病理变化表现异体骨在骨浅层出现由浅入深的血管化和骨哈佛氏管扩大、骨吸收、新骨形成，局部轻度炎性细胞浸润，异体骨表面有类破骨细胞、类骨母细胞存在，病理变化表现在同一标本中的不同区域病理变化程不同，有的区域仅有骨血管化，有的区域出现类破骨细胞，有的区域出现类骨母细胞，不同部位类骨母细胞、类破骨细胞分布数量及比例不同，诱导成骨质量不同；植入后12周病理切片与植入后8周时不同处为新骨形成稍增加，但异体骨吸收更加显著，血管已长入大部分骨哈弗氏管；植入后16周病理切片显示骨吸收明显，异体骨仅存在少量残存碎片，新生骨增加不明显，其周围类骨母细胞数量、类破骨细胞少。

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引言

因创伤、感染及骨肿瘤等原因造成骨及软组织复合组织缺损的治疗是修复重建外科领域较为普遍而又棘手的问题。目前临床解决方法主要为自体骨移植或和皮瓣移植，其中效果较佳的方法为自体骨皮瓣移植^[1-4] 。虽然自体骨、皮瓣移植有快速愈合、无免疫反应的特点,但来源及能修复程度有限，且造成自体供区局部创伤部分功能缺失、甚至功能障碍^[5] 。同种异体骨来源丰富，不受形态、大小限制，并具有良好的生物学特性和形态结构，与自体骨相近、可以长期储存等优点，是替代自体骨移植常用的材料。但手术直接置入受区的异体骨活性低，且受区多因创伤或手术等因素造成植入部位血管减少，血运差，使异体骨血管化障碍，成活困难、爬行替代不完全，易发生不愈合或愈合差；另外，还有远期效果不佳，失败率及并发症发生率较高等不足^[6] 。所以如何提高植入异体骨活性和提高修复合并大段骨缺损的复合组织缺损效果，是目前需解决的问题。
目前用组织工程骨修复缺损的实验研究已取得了一定成就^[7-9] ，为骨缺损修复提供了新的方法。制作组织工程骨三大要素中，使用的支架材料有胶原、明胶、纤维蛋白凝块、脱钙骨、羟基磷灰石、磷酸三钙、聚乳酸、聚羟基乙酸的等；常用的种子细胞有骨髓间充质细胞、脂肪基质细胞等；细胞因子主要有骨形态发生蛋白、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子等。组织工程骨用来修复骨缺损多局限于为单一小块骨缺损，对于复合组织缺损或大块骨缺损的修复受到限制，原因是组织工程骨血管化问题尚未有效解决，故无法制作大块有活性的组织工程骨。当局部血运差或合并软组织缺损时，就不宜使用组织工程骨修复。目前组织工程骨的血管化问题是困扰组织工程制作大块、复合组织的瓶颈。有人用血管束植入方式制作有血运的组织功能骨，但是操作复杂，且仍然需要受区有可用血管支^[10-12] 。另外，组织工程骨的安全性和植入后干细胞的调控问题为组织工程骨研究的困扰的问题。目前有人提出在体组织工程的概念，或许能成为解决上述问题的一个好的发展方向。异体骨与许多人工合成支架材料相比具有较多优点，如天然的三维结构、一定的机械强度、生物活性成分等，所以目前是应用较广泛的材料^[13-14] 。目前在组织工程修复骨缺损的研究中，多对异体骨进行脱钙、脱脂、脱蛋白等处理，使其机械强度、生物活性显著减弱，致其临床应用适用范围缩小^[15-18] 。对于上述问题，如能充分利用组织工程技术用异体骨制作出骨皮瓣，充使其具有骨皮瓣的优点，从而提高骨缺损修复的效果。作者已对异体骨异位埋植局部诱导形成具有活性的骨皮瓣可行性进行了研究，结果显示可以对用异体骨预制骨皮瓣，但对病理过程缺乏系统观察，文章进一步观察异体骨预制骨皮瓣过程中系统的病理变化，以期为临床应用提供理论依据。

材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：于2011年2至7月在济宁医学院动物实验中心完成。

材料：普通级广西巴马微型猪12头，雄性，3月龄，由泰州泰和生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK(苏)2011-0002)。其中6只处死用以取深低温冷冻异体股骨，6只用作异体骨植入动物模型。实验过程中对动物的处理参照中华人民共和国国家科学技术委员会《实验动物管理条例》(1988年)相关动物伦理学标准。

实验方法：

深低温冷冻异体骨的制备：因解剖需要而处死的健康雄性微型猪6头，于无菌操作下取出股骨(12根)，剔除骨上软组织，取3 cm长中段皮质骨，刮除髓腔骨髓，并用生理盐水刷洗髓腔，浸泡于庆大霉素盐水(每500 mL 16×10⁴ U)中30 min^[19]。无菌纱布拭干骨面水滴后无菌纱布包裹，装入无菌PE塑料袋，双层包装后热压封口，然后于-96 ℃深低温冰箱保存4周以上，备用。

麻醉方法：用戊巴比妥钠肌肉注射诱导麻醉(注射量 30 mg/kg)，并给以静脉追加(每半小时给以3%的戊巴比妥纳2 mL左右，30滴/min)，维持微型猪于麻醉状态中^[20]。

异体骨植入：用6头微型猪，根据解剖，确定以旋髂浅动脉为蒂的皮瓣供区，在皮瓣区内切口，并于皮瓣内解剖处一段约2 cm长的血管束；将异体冷冻骨用庆大霉素盐水(每500 mL 16×10⁴ U)冲洗复温，复温后将异体骨分别置入皮瓣皮下组织中，异体骨缝合固定，将解剖出的血管束置于异体骨髓腔内，缝合固定异体骨，见图1；术中彻底止血；缝合关闭切口。每头猪分别于左右两侧植入异体骨(共12侧)。

植入后处理：异体骨植入当天至植入后3 d每天肌注头孢曲松钠(100 mg/kg，溶于1%利多卡因溶液内)1次/d，切口处喷涂碘伏(5 g/L)1次/d。

大体病理观察：于植入前和植入后4，8，12，16周观察微型猪异体骨植入部位的反应并随机取3侧异体骨行大体观察。

镜下病理观察：标本经大体观察后行体积分数10%甲醛溶液固定后，经脱钙，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，封装后，于放大100和200倍光镜下观察异体骨及周围病理变化。

主要观察指标：于植入前和植入后4，8，12，16周观察微型猪异体骨植入部位的反应变化，并随机取3侧异体骨行大体及光镜下病理切片观察，观察异体骨及周围病理变化。

讨论

3.1 异体骨局部免疫反应 异体骨未经处理有明显的抗原性，直接植入会引起明显的免疫排斥反应。目前通过植入前的一定的加工处理过程，可降低其抗原性。不同制备方法影响异体骨的抗原性，所以在制备异体骨时，如何去除异体骨的免疫原成为异体骨处理过程的中心环节。骨内抗原为骨内蛋白、脂肪，存在于骨组织、细胞膜上。目前制备异体骨的方法较多，如脱钙骨、脱脂骨、去蛋白骨、冻干骨、深低温冷冻骨、⁶⁰Co照射骨等^[21-23] 。去除异体骨的脂质、蛋白，用化学方法脱脂可较彻底去除骨内脂肪，但处理复杂，对骨的物理强度产生较大影响，对大段异体骨移植不适宜。因深低温冷冻骨能显著降低异体骨的抗原性，且能保留骨形态及较好骨强度，而临床骨缺损部位大多需要植入有一定强度的材料起到支撑、稳定作用，故冷冻骨为首选材料。作者这次实验用深低温冷冻异体骨为材料，从实验过程中异体骨植入处的大体观察和镜下病理检查未发现明显排异反应。实验中机械方法，将骨髓腔内骨髓及附着软组织尽量刮除，再用刷洗及大量生理盐水冲洗，可去除大部分骨的脂肪成分，显著减少了产生排斥反应的重要免疫致敏原，然后再进行深低温冷冻处理使异体骨的抗原性降低，从而使局部的免疫反应不明显，有利于异体骨异位植入后稳定的发挥生物活性功能。李春威等[24]用深低温冷冻异体骨和自体骨进行修复眶骨缺损，结果显示 2种骨修复效果接近，这一结果也说明本实验选用深低温冷冻异体骨是合理的。另外，实验所用动物为巴马香猪，其为自然纯化的种系，其本身固有的异体间组织相容性好，这次实验所获得深低温冷冻异体骨植入后免疫排斥反应不明显是否与此有关，需进一步研究。
3.2 异体骨的骨诱导活性 大量的临床研究表明，同种异体骨具有骨组织的完整性结构、机械稳定性、生物学活性、骨诱导能力和极低的免疫性以及与宿主骨有较强的愈合能力等优点，所以同种异体骨成为目前修复治疗大段骨缺损的重要手段之^[25-27] 。
异体骨移植骨诱导的物质基础是骨基质中骨形态发生蛋白。Pietrzak曾研究得出, 脱钙作用利于骨基质中骨形态发生蛋白释放，提高骨形态发生蛋白的生物利用度,使其骨诱导活性得到最佳的发挥。Urist认为骨移植后1周左右开始出现骨诱导，外源性同种异体脱钙骨中含有的骨形态发生蛋白释放和由间充质细胞分泌的内源性骨形态发生蛋白发挥诱导成骨作用。而临床大多需要未经脱钙的大段异体骨，移植后大段异体骨内骨形态发生蛋白很难释放出来发挥骨诱导作用。有实验观察到, 大段骨移植后不管自体骨段还是异体骨段，其免疫组化结果骨形态发生蛋白均呈阴性，移植骨自身无骨形态发生蛋白表达，骨形态发生蛋白阳性表达主要在于新生骨的成骨细胞和类基质中，通过诱导组织基质细胞等分化成软骨、骨细胞而产生新骨，而新生骨的成骨细胞又能分泌骨形态发生蛋白，使其产生良性循环，所以他们认为大段移植骨愈合过程，主要是依靠骨传导，其次才是骨诱导，且由新生骨产生骨形态发生蛋白发挥诱导作用，并非为异体骨段本身[^28-29] 。本实验的异体骨为未脱钙骨，按既往研究结论，认为其内骨形态发生蛋白很难释放发挥骨诱导作用，且异体骨为异位埋植，不存在骨传导，而实验结果仍显示异体骨浅层有类骨母细胞及新骨形成，说明大段异体骨移植后仍然存在骨诱导。其表现异体骨由浅入深出现血管化，同时伴有哈弗氏管的扩大、骨吸收，随后才出现类骨母细胞和新骨形成，显示新骨形成与骨血管化有密切关系。作者推断异体骨的骨诱导并不完全是异体骨主动诱导，而是和受体生物相互作用结果；冷冻处理的大段异体骨虽然很难释放骨形态发生蛋白，但是生物体固有的将异体骨血管化的能力，通过血管化和骨吸收，使异体骨内骨形态发生蛋白释放，从而发挥骨诱导，所以在局部血运越好这种作用越明显。另外，异体骨移植后的骨诱导活性还与异体骨抗原性、局部免疫反应密切相关，有研究认为异体骨的诱导成骨与局部免疫反应成负相关。所以有效降低异体骨的抗原性，减少其局部免疫反应程度，有利于骨诱导作用的发挥。本实验结果显示经过一定时间后异体骨置入处出现明显的类骨母细胞及新生骨，所以作者异体骨经深低温冷冻处理后降低抗原性显著减低，这种骨的可以作为异位诱导预制骨皮瓣的材料。
实验中还观察到异体骨骨诱导活性随时间变化，早期表现骨诱导，出现类骨母细胞和新骨形成，随着时间延长，如异体骨置入12周后类骨母细胞退变、减少，并出现大量骨吸收。这说明骨诱导作用的发挥和维持除以上因素外，还有其他因素，故需要进一步深入研究骨诱导机制。
3.3 异体骨病理变化与预制骨皮瓣移植时间点问题 预制骨皮瓣移植最好在异体骨骨有血管化、骨诱导、类骨母细胞和新骨形成时，且异体骨没有出现明显骨吸收时，这样才有较好的临床价值。实验中观察到异体骨自身的变化随时间在动态变化。异体骨在4-8周时骨形态维持好，出现少量骨吸收和开始骨诱导。而在12周后异体骨表现明显骨吸收和新骨形成，16 周后原植入骨形态已不存在，代之以少量散在的新生骨。这一过程说明异体骨骨诱导启动后需要后续的因素才能继续维持和增强，否则将向停止、退化发展。有学者通过对比血管束植入和带血运筋膜包裹异体骨治疗骨缺损的研究，发现带血运骨膜瓣包裹异体骨修复骨缺损优于单纯血管束植入同种异体骨修复骨缺损，前者在骨痂形成和髓腔再通较后者快，这说明异体骨病理变化与局部血运密切相关。另外，异体骨的病理变化并不是在前表面均匀变化，而是同一异体骨，不同区域病理变化并不完全一致，血管化、骨吸收、骨诱导在不同区域可能不同。王垚等^[30]的研究发现血管内皮生长因子在异体骨植入后骨缺损愈合不同时期、不同部位表达各异，这从一个方面解释了病理变化不同原因。由于异体骨的血管化、骨吸收、骨诱导密切相关：骨诱导是以血管化和骨吸收为前提，但后期过度的骨吸收又影响骨诱导。所以，异体骨埋置后出现骨吸收和血管化时间影响异体骨皮瓣的应用^[31] ，应该在骨有血管化且没有出现明显骨吸收时，进行移植，才有较好的临床价值。实验结果提示，异体骨植入后4-8周进行骨皮瓣移植可能为较佳时间。这一过程的具体原理和效果需要进一步研究。
3.4 在体异位骨诱导预制骨皮瓣的意义 本实验提示可以用异体骨预制骨皮瓣。这为临床工作遇到的中合并有软组织缺损、血运障碍的大段骨缺损的病损提供了新的解决方法，也为显微外科技术与在体组织工程技术相结合研究和应用提供了一个新的思路。预制异体骨皮瓣具有预制皮瓣的优点，即可不受原来血管解剖及及皮瓣长宽大小限制，可以根需要设计预制骨及皮瓣大小、皮瓣厚度等；另外，克服了自体骨来源有限、不能满足大段骨缺损的需要的缺点；而且，预制后异体骨有较好的稳定血运和良好的活性。因为异体骨预制骨皮瓣的上述优点，如果再能将预制皮瓣和组织功能的先进技术应用到异体骨预制骨皮瓣中^[32]，则可能获得较好的预期临床应用价值。但最佳移植时间、影响因素、移植效果以及移植病理变化机制需进一步研究。

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[15]	梁彦峰, 郝鹏, 段红梅, 赵文, 高钰丹, 李晓光, 杨朝阳. 成年小鼠缺血性脑卒中后病理及行为功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5625-5631.